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    慢病毒制備和導入細胞的操作步驟及注意事項

    發(fā)布時間: 2024-06-06  點擊次數(shù): 291次

    前置知識

    通過病毒介導將核酸導入哺乳動物細胞是一種常用的實驗技術(shù),被廣泛用于基因傳遞、基因表達和功能研究等領(lǐng)域。這個實驗通常分為以下6個部分:


    1.選擇適當?shù)牟《据d體:常用的病毒載體包括腺病毒(Adenovirus)、腺相關(guān)病毒(Adeno-associated virus,AAV)和逆轉(zhuǎn)錄病毒(Retrovirus)。


    2. 構(gòu)建表達載體:將目標核酸(例如基因、RNA等)插入到病毒載體的適當位點上,構(gòu)建表達載體。這通常涉及將目標核酸序列克隆到適當?shù)谋磉_載體質(zhì)粒中,并進行驗證和測序。


    3. 病毒包裝和擴增:將構(gòu)建好的表達載體轉(zhuǎn)染到特定的包裝細胞中,這些細胞能夠產(chǎn)生具有完整病毒基因組的病毒顆粒。病毒顆??梢酝ㄟ^細胞培養(yǎng)和病毒擴增過程進行大規(guī)模生產(chǎn)。


    4.細胞轉(zhuǎn)染:將目標哺乳動物細胞培養(yǎng)在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中,然后將病毒顆粒加入培養(yǎng)基中與細胞進行共培養(yǎng)。病毒顆粒會與細胞表面的受體結(jié)合,并進入細胞內(nèi)部。


    5.核酸導入和表達:一旦病毒進入細胞內(nèi)部,它會釋放出核酸負鏈,該負鏈會被細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯機制利用。目標核酸的表達產(chǎn)物(例如蛋白質(zhì))會在細胞內(nèi)合成,并根據(jù)實驗需要發(fā)揮其功能。


    6.實驗分析:根據(jù)實驗目的,可以對細胞和表達產(chǎn)物進行進一步的分析。這可能包括檢測蛋白質(zhì)表達水平、功能研究、細胞行為觀察等。


    操作步驟

    A 慢病毒制備:

    1、提前一周復蘇293T細胞,使用10% FBS-DMEM培養(yǎng)基傳代3次以上。


    轉(zhuǎn)染前一天將生長狀態(tài)良好的293T細胞用0.25%胰酶消化,得到細胞懸液,計數(shù),然后進行慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,稀釋到10個/mL;

    將293T接種到6孔板(每孔接種2 mL),使其密度為40%。

    待其生長到孔板面積80-90%進行轉(zhuǎn)染。

    2、通過質(zhì)粒大提獲得無內(nèi)毒素質(zhì)粒。

    3、在1.5mLEP管中分別加入150μL DMEM培養(yǎng)基、15μL lipofectamine 2000。

    4、在1.5 mL EP 管中分別加入700μL DMEM培養(yǎng)基、7μg目的DNA、5.25μg的psPAX2、1.75μg的pCMV-VSVG(使三條質(zhì)粒質(zhì)量比為 4:3:1)。

    5、將等體積的質(zhì)?;旌衔锛尤氲睫D(zhuǎn)染試劑混合物中,室溫靜置5min。

    6、將隔夜培養(yǎng)的6孔板中培養(yǎng)基小心吸出,替換為新鮮DMEM(血清)細胞培養(yǎng)基。每個孔中加入300 μL的DNA-lipo 2000復合物。

    7、分別在轉(zhuǎn)染后24h、48h,收集六孔板中病毒上清液,經(jīng)0.45μm的濾膜過濾或離心去除細胞碎片(短期內(nèi)可放于4℃保存,長期保存于-80℃冰箱,勿反復凍融)。

    B 慢病毒感染:

    1、提前一周復蘇靶細胞,傳代三次以上保證細胞生長狀態(tài)良好。病毒感染前一天將靶細胞傳代到6孔板,使細胞生長密度為約20%。

    2、待細胞生長至孔板面積50-60%時,加入2ml病毒液,加入polybrene,并補加0.5ml(血清)細胞培養(yǎng)基,恒溫培養(yǎng)24h。

    3、用(血清)細胞培養(yǎng)基更換病毒液,恒溫培養(yǎng)24h。

    4、加入適量的抗生素篩選,每次換液時補加抗生素,至靶細胞細胞無明顯死亡。

    注意事項:

    1.選擇合適的載體和元件:根據(jù)實驗需要選擇適當?shù)馁|(zhì)粒載體和啟動子,例如CMV啟動子、SV40啟動子等。

    2. 細胞狀態(tài)和轉(zhuǎn)染密度:細胞狀態(tài)好,且處于指數(shù)生長階段。靶細胞密度不宜過高或過低,建議將細胞密度控制在指數(shù)期的70-80%;

    3. 選擇合適轉(zhuǎn)染試劑、比例和轉(zhuǎn)染時間:選擇適當?shù)霓D(zhuǎn)染試劑,不同類型的細胞和外源DNA可能需要使用不同的試劑進行轉(zhuǎn)染;

    同時,還需要對慢病毒質(zhì)粒、DNA和轉(zhuǎn)染試劑的比例、轉(zhuǎn)染時間進行優(yōu)化??稍诟腥景屑毎麜r加入適量的聚凝胺提高轉(zhuǎn)染效率。

    4.抗生素濃度:可在轉(zhuǎn)染前做MTT實驗探究其工作濃度,選取合適的篩選濃度使轉(zhuǎn)染的細胞能夠存活并形成穩(wěn)定的細胞系。

    5.篩選時間:在進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染實驗時,需要進行足夠長的篩選時間以檢測出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系,轉(zhuǎn)染后可通過WB,流式細胞術(shù),Dot blot等方法驗證。


    6.對照組設(shè)置:設(shè)置陽性和陰性對照以評估轉(zhuǎn)染效果和篩選是否成功。


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