原理：

 CCK-8全稱"Cell Counting Kit-8"，是一種基于WST-8的應(yīng)用于細胞增殖和細胞毒性的快速、高靈敏度檢測試劑盒。其工作原理為在電子耦合試劑存在的情況下，WST-8這一物質(zhì)可以被線粒體脫氫酶還原成橙黃色的甲臜產(chǎn)物，且其顏色深淺與細胞增殖程度成正比，與細胞毒性程度成反比。

實驗步驟：

 1）制備細胞懸液：若為懸浮細胞則直接離心收集對數(shù)生長期的細胞；若為貼壁細胞則用胰酶消化后離心收集細胞。將收集到的細胞用含血清培養(yǎng)基重懸后，用血細胞計數(shù)板計數(shù)，再稀釋為5×10^3~5×10^4個/ml的單細胞懸液。

2）在96孔板中接種細胞懸液，每孔100μl，同時設(shè)計不同的濃度組，每個濃度組可設(shè)計3~6個復孔，且設(shè)置好空白組和對照組。

3）將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)24h左右（37℃, 5%CO2）。

4）向培養(yǎng)板各孔中加入不同濃度的待測物質(zhì)（藥物、化學試劑等）放入培養(yǎng)箱中孵育6~96h。

6）向每孔中加入10μl CCK-8溶液，加完試劑后輕輕晃動培養(yǎng)板以幫助混勻（防止因CCK8試劑沾在孔壁上而帶來的誤差），加樣的過程中盡量不要產(chǎn)生氣泡，以免影響OD值讀數(shù)。

7）將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中孵育1-4h。

8）用酶標儀測定450nm處的吸光度（OD）。

注意事項:

（1）接種細胞數(shù)：針對標準96孔板，貼壁細胞的最小接種量為1000個/孔 (100μl培養(yǎng)基)。若為白細胞，接種量不低于2500個/孔 (100μl培養(yǎng)基)。若使用24孔板或6孔板，應(yīng)預先計算每孔相應(yīng)的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的10%加入CCK-8溶液。

（2）在細胞毒性實驗中，還應(yīng)考慮藥物的吸收，可在加入藥物的培養(yǎng)基中加入CCK-8，測定450nm的吸光度作為空白對照。

（3）在培養(yǎng)箱中孵育期間，培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā)，造成體積不準確，從而增加誤差，因此，建議最外一圈的孔只加PBS，不作為測定孔用。

（4）加入待測物之后培養(yǎng)的具體時間6~96h要看待測物質(zhì)的性質(zhì)和細胞的敏感性，例如6、12、24、48h。實驗時可以選擇不同作用時間下進行細胞毒性檢測。

（5）如果待檢測物質(zhì)有氧化性或還原性，在加入CCK-8之前要更換新鮮培養(yǎng)基，以去掉待測物質(zhì)的影響。如果影響比較小或者沒有影響，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。

（6）正常顯色時間為1-4h，可以每半小時測定一次OD值，使其OD值保持在1-2之間后固定顯色時間重復實驗。

（7）因為細胞種類不同，形成的formazan的量也不一樣，所以如果顯色不夠的話，可以延長培養(yǎng)時間，特別是血液細胞需要較長的顯色時間（5-6h）。

（8）測定波長：如果樣品為高渾濁度的細胞懸液，建議采用雙波長進行測定，檢測波長450-490nm，參比波長600-650nm，建議選650nm。

（9）若暫時不測定OD值，可以在各孔中加入10μl 0.1 M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，室溫避光保存， 24h內(nèi)測定OD值不會發(fā)生變化。

（10）新鮮的CCK-8試劑為粉紅色，儲存時間過長則顏色加深、效率變低，最好不使用。通常情況下CCK-8試劑在0-5℃避光條件下可保存至少6個月，在-20℃下避光可以保存1年。

常見問題

為什么復孔之間的重復性不好？

（1）可能在接種細胞時不小心帶入了氣泡。為避免這種情況，應(yīng)及時更換槍頭，且沿著側(cè)壁將細胞懸液加入96孔板中，避免槍尖在打液的過程中插入液面下方從而產(chǎn)生氣泡。若已經(jīng)產(chǎn)生氣泡，可用1ml注射器針頭燒熱后將氣泡戳破減小誤差。

（2）可能是在換液過程中將貼壁的細胞滑散了。為避免這種情況請在細胞貼壁后注意沿側(cè)壁底面利用槍頭的虹吸作用將孔內(nèi)的培養(yǎng)基吸取出來。

（3）可能是在換液過程種沒有將孔內(nèi)的液體洗凈就加入了新的培養(yǎng)基。

（4）可能是加入的CCK-8試劑微量沒有加準。為避免這種情況，可以直接配制含10% CCK-8的培養(yǎng)基，以換液的形式加入96孔板中，每孔100μl。

計算方法

細胞抑制率 =（對照-實驗）/（對照-空白）×100%

對照：具有細胞、培養(yǎng)基、CCK-8的孔的OD值

實驗：具有細胞、培養(yǎng)基、CCK-8和藥物溶液的孔的OD值

空白：具有培養(yǎng)基和CCK-8的孔的OD值

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