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從骨骼肌分離和培養(yǎng)單肌纖維的方法步驟
發(fā)布時(shí)間： 2021-11-15 點(diǎn)擊次數(shù)： 2133次材料與儀器
Matrigel DMEM L-谷氨酰胺 Ⅰ型膠原蛋白
青霉素和鏈霉素混合液 雞胚提取液 馬血清 胎牛血清 接種培養(yǎng)液 增殖培養(yǎng)液
Petri培養(yǎng)皿 改良Pasteur吸管 24孔培養(yǎng)板 鉆石筆 透照立體解剖顯微鏡步驟
1. 處死動(dòng)物后立即切除肌肉。注意夾持肌腱，以減少對肌纖維的損傷。
2. 將肌肉放入 0.2 % Ⅰ型膠原蛋白酶液（W / V，用 DMEM 配制），在 35°C 條件下用搖動(dòng)水浴箱孵育 60~90 min。較大肌肉需要較長消化時(shí)間，一般情況下取自 6~8 周大鼠的趾長伸肌需消化 60 min 。
3. 準(zhǔn)備盛肌纖維的 Petri 培養(yǎng)皿，即用馬血清浸洗培養(yǎng)皿，以免肌纖維黏附于培養(yǎng)皿底壁上。然后，加入 20 ml DMEM。
4. 消化后將肌肉移入盛有 DMEM 的 Petri 培養(yǎng)皿。
5. 在透照立體解剖顯微鏡下，用改良 Pasteur 吸管（將 Pasteur 吸管割斷，用鉆石筆將開口弄大。然后，用火使鋸齒狀邊緣變光滑，以免損傷肌纖維）研磨肌肉，使單肌纖維分散。
用 10 % 馬血清（用 DMEM 配制）浸蘸吸管，以免肌纖維黏附吸管。
6. 肌纖維被分散時(shí)，肌肉的直徑變小。逐漸用口徑小的 Pasteur 吸管。
7. 當(dāng)分離 20~30 條肌纖維時(shí)，將肌肉移入另一 Petri 培養(yǎng)皿，繼續(xù)分離，直至分離得到足夠的肌纖維。
8. 較大肌肉需要第二次消化，以分散位于中央處的肌纖維。表淺的肌纖維被分離后，將剩余的肌肉放人膠原蛋白酶液，進(jìn)一步消化。
9. 將肌纖維放入涂有 Matrigel （1 mg/ml，用 DMEM 配制）的培養(yǎng)皿。
(a)將單肌纖維放于培養(yǎng)皿中央，讓其貼于 Matrigel。為了培養(yǎng)純單肌纖維，只放入未損傷的肌纖維，除去較皺縮部分。這些部分可能有污染的附著細(xì)胞，多為微血管段；
(b)慢慢加入接種培養(yǎng)液（DMEM，添加 10% 馬血清、0.5% 雞胚提取液、4 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 鏈霉素），注意勿移動(dòng)接種的肌纖維。
10. 將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱，在 37°C 和 5 % CO2 條件下培養(yǎng)。
增殖
培養(yǎng) 12~24 h 后，衛(wèi)星細(xì)胞開始從肌纖維遷出。至 3~4 天，每條肌纖維周圍有 50~300 個(gè)衛(wèi)星細(xì)胞。確切細(xì)胞數(shù)取決于肌纖維來源的肌肉和小鼠周齡等多種因素 [ Bockhold et al.，1998 ] 。
11. 許多衛(wèi)星細(xì)胞從肌纖維遷出時(shí)，用 Pasteur 吸管將肌纖維吸出。應(yīng)在火焰上將吸管尖部拉細(xì)。
12. 繼續(xù)培養(yǎng)剩余的細(xì)胞。
13. 如果需要，可傳代培養(yǎng)，用增殖培養(yǎng)液（DMEM，添加 20% FBS、10% 馬血清、1% 雞胚提取液、4 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 鏈霉素）接種細(xì)胞。
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