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初代細(xì)胞培養(yǎng)——消化培養(yǎng)法

發(fā)布時(shí)間： 2021-11-08　　點(diǎn)擊次數(shù)： 1819次

材料與儀器
組織
Hanks 培養(yǎng)液胰蛋白酶
吸管平皿培養(yǎng)瓶燒杯攪拌器三角燒瓶不銹鋼篩眼科剪眼科鑷計(jì)數(shù)板
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 準(zhǔn)備

取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于凈化臺(tái)面，紫外線消毒20 分鐘；

2. 布局

點(diǎn)燃酒精燈（或煤氣燈），安裝吸管帽（應(yīng)通過火焰）；

3. 處理組織

把組織塊置入燒杯中，用Hanks液漂洗2~3 次，去除血污；如懷疑組織可能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中30~60 分鐘；

4. 剪切

用眼科剪把組織塊切成2~3 毫米大小的塊（用手術(shù)刀割亦可），以便于消化；加入比組織塊總量多30~50 倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角燒瓶中，結(jié)扎瓶口或塞以膠塞；

5. 消化

或用恒溫水浴，或置入37 ℃溫箱消化均可，消化中每隔20 分鐘應(yīng)搖動(dòng)一次，如用電磁恒溫?cái)嚢杵飨茫ㄏ捌恐行柚靡粺o菌攪棒）；消化時(shí)間依組織塊的大小和組織的硬度而定；

6. 分離

在消化過程中見消化液發(fā)混濁時(shí)，可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察，如組織已分散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，立即終止消化，隨即通過適宜不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化開的組織塊（必要時(shí)可繼續(xù)進(jìn)行消化）；低速（500~1000 轉(zhuǎn)/分）離心消化液5 分鐘，吸出上清，加入適量含有血清的培養(yǎng)液（如有其它酶或EDTA 等消化，需用Hanks液洗脫一兩次后，再加入培養(yǎng)液）；

7. 計(jì)數(shù)

用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，如細(xì)胞懸液細(xì)胞密度過大，再補(bǔ)加培養(yǎng)液調(diào)整后，分裝入培養(yǎng)瓶中；對(duì)大多數(shù)細(xì)胞來說，pH 要求在7.2~7.4范圍，培養(yǎng)液呈微紅色，如顏色偏黃，說膽液體變酸，可用NaHCO3調(diào)整；

8. 培養(yǎng)

置入36.5 ℃溫箱培養(yǎng)；如用CO2溫箱培養(yǎng)，瓶口需用紗布棉塞或螺旋帽（松口）堵塞，紗布塞易生霉菌，每次換液時(shí)需更換新塞。

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